原位杂交组化（ISHH）与免疫组织化学（IHC）结合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH与IHC结合法可以在相邻切片上分别进行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上进行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色过程中污染有少量RNase的液体所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。

　　一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序

　　（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。

　　（2）0.1 mol/L 甘氨酸PBs 5min。

　　（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。

　　（4）1 μg/ml蛋白酶K，37 ℃保温30min。

　　（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。

　　（6）PBS冲洗2×3min。

　　（7）0.25%乙酸酐（0.1 mol/L 三乙醇胺配）10min。

　　（8）2×SSC冲洗10min。

　　（9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10 μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，³H标记探针每10μl杂交液含1×10⁵cpm探针，³²P或³⁵S标记探针每10 μl杂交液含5×10⁵cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43 ℃保温12～16h。

　　（10）4×SSc 37 ℃冲洗10～30min。

　　（11）2×SSC（如为RNA探针则含20 μg/ml RNase）37 ℃冲洗30min。

　　（12）1×SSC和0.1×SSc 37 ℃分别冲洗30min。

　　（13）PBS冲洗2×5min。（转录ISHH）

　　（14）0.5%H₂O₂PBS室温30min。

　　（15）1%BSA 37 ℃，30min 。

　　（16）第一抗体，4 ℃孵育16～24 h。

　　（17）PBS冲洗4×5min。

　　（18）第二抗体37 ℃，1 h。

　　（19）PBS冲洗3×5min。

　　（20）兔PAp 37 ℃，1 h 。

　　（21）PBS冲洗3×5min。

　　（22）DAB显色液5～10min（DAB显色液：0.05%DAB + 0.03% H₂O₂PBS液配）。

　　（23）PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。

　　（24）切片入70%，85%，95%和2个100%酒精脱水，空气干燥。

　　（25）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6 mol/L醋酸胺=1：1），晾干，装入自显影暗盒。

　　（26）4 ℃曝光：³H标记探针4～8周，³⁵S标记探针1～4周，³²P标记探针7～10天。

　　（27）D₁₉₆显影液，20 ℃显影5～10min。